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                  技術支持

                  古朵帶大家來了解:七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)
                  更新時間:2023-11-23   點擊次數:195次

                    七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)


                    六色多重免疫疫熒光試劑盒(五標六色)50T 盒 5388

                    六色多重免疫疫熒光試劑盒(五標六色)100T 盒 8980

                    備注:二抗根據客戶要求羊抗兔或鼠兔通用二抗 染料: 綠光 紅光 古朵生物

                    原理介紹:酪酰胺信號放大(TSA,Tyramidesignalamplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法,類似常規免疫組化的DAB顯色方法,TSA技術同樣采用HRP標記的二抗,同樣有對應的“顯色"步驟(HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物,產生活化熒光底物,活化底物可與抗原上的LUOANSUAN等殘基共價結合,使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物,重復下一種一抗-hrp二抗來 第二輪孵育,換另一種酪胺熒光素底物,如此往復就可實現多重標記。

                    TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結合位點),產生大量的酶促產物,該產物能與周圍的蛋白殘基(包括seansuan、zuansuan和nuoansuan 殘基)結合,這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積,結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說,用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯熒光素),來催化后續添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,跟臨近蛋白的nuoansuan殘基共價偶聯,使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理, 前一輪非共價結合的抗體被洗掉,共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育,周而復始。等到所有抗體孵育結束,熒光素都結合好后,最后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育,因此無需擔心抗體交叉反應,以及一抗二抗種屬匹配問題,大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說,如果用TSA技術,同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗,而且信號放大的倍數大大增強。本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種:480,520,570,620,690,780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用??梢詫崿F單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能,極大豐富了此試劑盒的內涵。

                    試劑盒組成:480熒光染料(即用型,5mL),-20℃;520熒光染料(綠光)(即用型,5mL),-20℃;570熒光染料(紅光)(即用型,5mL),-20℃;620熒光染料(即用型,5mL),-20℃;690熒光染料(即用型,5mL),-20℃;780熒光染料(即用型,5mL),-20℃;TSA+增強劑,100ul,-20℃(可選);

                    高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(20mL)4℃。

                    備注:480熒光染料、520熒光染料、570熒光染料、620熒光染料、690熒光染料、780熒光染料在-20度下,均為固體,使用之前需解凍。

                    TSA+增強劑使用方法:TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍,TSA+增強劑:TYR熒光放大液=1:500,使用TSA+增強劑不是必須的選項,可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

                    操作流程:

                    1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二jiabenⅠ15min-二jiabenⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ。取出放在通風廚內, 酒精晾干后放入自來水中稍洗,蒸餾水洗。

                    2、抗原修復:組織切片置于盛滿PH9.0EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復(也可以用高壓1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他熱修復方法)。中火8min,?;?min,轉中低火7min,此過程中應防止緩沖液過度蒸發,切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復液和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定)。

                    3、阻斷內源性過氧化物酶:切片放入3%GUOGHUAQING,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。

                    4、BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。

                    5、加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X, 切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發)

                    6、加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次, 每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min,PBS洗三次。

                    7、熒光染料反應:XXX熒光染料反應10-15min,PBS洗三次。

                    8、重復2-7步驟(換用另外一種XXX熒光染料)

                    9、DAPI復染細胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。

                    10、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

                    11、鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖像。

                    染料激發波長發射波長

                    DAPI 藍色350  420

                    480   450   480

                    520 綠色490  520

                    570 紅色550   570

                    620    590   620

                    690    630   690

                    780   750   780

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