ELISA法可檢測幽門螺桿菌的抗體

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　?、?0孔聚苯乙x微量凹孔板：

　?、诿嘎摪咫x心籃：根據40孔酶聯板本實驗室自行設計制成。

　?、跠G—Ⅰ型酶聯免疫檢測儀：

　?、茉噭哼^氧化物酶(HRP)，R2=3.2，美國Sigma公司產品。鄰苯二a(OPD)：按文獻配制。包被液：取碳酸鈉1.59g加2.93g，蒸餾水1000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液：5%小牛血清。戊二q固定液：25%戊二q液，100ml裝，Kochligh進口分裝，用時稀釋成0.25%戊二w固定液。終止液：2NH2SO4。

　?、菘乖闹苽洌簩拇罄麃?佩思醫院的Hp標準菌株(NCTC11638)及從胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板，37℃培養5d后取菌落作生化與血清學鑒定(自制兔抗Hp抗體)，然后取單個菌落移種于另一血平板，繼續培養3d，經鑒定后將其大量增殖培養，3d后將菌苔刮下，置生理鹽水中制成菌液，加福爾馬林固定(0.1%～0.3%)，4℃過夜，3000r/nin離心30min，沉淀3次，將zui后1次沉淀懸于少量PBS液內，用比濁管沒出細菌濃度，制成含菌3×109ml，置冰箱冰凍，反復凍融3次，經顯微鏡檢查無菌體存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，-20℃保存備用。

　?、夼R床血清標本：采自胃鏡檢查患者，隨機采取1988年8～10月胃鏡檢查病人共38人，抽靜脈血2ml，分離血清貯存-20℃備用。

　?、哧幮詫φ昭?，進行ELISA測定，取其平均OD值作對照。

　?、嗝笜搜蚩谷薎gG結合物(SAHIgG—HRP)的制備：按過碘s鹽改良法，略加改進標記制成酶標抗體。即HRP8.0ml，22℃較攪20min。加乙二醇6滴，繼續攪拌5min，對pH4.2，0.001mol/L醋酸鹽緩沖液(用2molHC1調pH)透析過夜，中間換水4次，加羊抗人IgG14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸鹽緩沖液，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h，加硼氫化(4mg/ml)0.2ml，置4℃2h，對pH7.2，0.01molPB-0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡。換水4次，收取透析袋內結合物，以50%飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后，測定精制結合物，E/P克分子比值合格后，將結合物小瓶分裝置-20℃保存，備用。

　?、崮蛩孛笢y定法和Hp的分離培養法參考文獻進行。

　　1.2 方法

　　并稍加改進，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×108億/ml(含蛋白8.6μg)稀釋后，每孔加100μ，離心籃離心20min2000r/min后，倒去孔內液體，然后加入0.25%戊二q液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二q，用洗滌液洗3次(每次3min)，加5%小牛血清液，200ml/孔，經37℃30min封板后倒去孔內液體。每孔加待檢血清(1：100稀釋)100ml，37℃保溫1h后，如上洗滌3次，同時做陰性對照孔和空白孔。之后于各孔內加和新鮮稀釋的酶標羊抗人IgG結合物100ml，37℃保溫半小時，于各孔中加入2NH2SO450μl終止反應后，于酶聯測定儀以波長490nm測定OD值，將測得標本OD值(P)與陰性對照OD值(N)比(P/N)，若P/N比大于或等于2.0為陽性。

　　上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。