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                  技術支持

                  瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程
                  更新時間:2021-09-23   點擊次數:1442次
                    凝膠電泳操作注意事項:
                   
                    1. 緩沖系統:在沒有離子存在時,電導率最小,DNA不遷移,或遷移極慢,在高離子強度的緩沖液中,電導很高并產熱,可能導致DNA變性,因此應注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時,常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環是可取的。
                   
                    2. 瓊脂糖:不同廠家、不同批號的瓊脂糖,其雜質含量不同,影響DNA的遷移及熒光背景的強度,應有選擇地使用。
                   
                    3. 凝膠的制備:凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致,溶解的凝膠應及時倒入板中,避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡,影響電泳結果。
                   
                    4. 樣品加入量:一般情況下,0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量,加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定,過多的量會造成加樣孔超載,從而導致拖尾和彌散,對于較大的DNA此現象更明顯。
                   
                    5. 電泳系統的變化會影響DNA的遷移,加入DNA標準參照物進行判定是必要的。
                   
                    6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率,平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。
                   
                    7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度,遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子,制備瓊脂糖凝膠可根據DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。
                   
                    瓊脂糖加樣時候注意事項:
                   
                    1、 用移液搶將樣品加至點樣孔。每孔點樣的體積一般少于25ul,因此吸取每一個樣品時,操作要穩當且細心。
                   
                    2、 常加一定量的蔗糖來增加樣品的濃度,以使每個樣品停留在各自的點樣孔中。
                   
                    3、 在樣品中加入水溶性的陰離子追蹤染料(如溴酚藍),用以看出樣品移動的距離。
                   
                    4、 在一個或幾個孔中加入標準分子質量樣品,電泳結束后,根據已知分子質量的帶的相應位置可用來做出標準曲線。
                   
                    5、 電泳一般是在追蹤染料泳動到膠的80%部位時停止。注意電泳期間,電泳槽蓋要安全蓋好,以防止液體蒸發,又可以降低電擊的可能性。
                   
                    6、 電泳結束后,將膠浸沒在1mg/L的溴化乙錠(EB)中,5min后即可看到DNA帶,EB通過插入在雙螺旋的配對核苷酸之間同NDA結合。另一種方法是電泳時,在膠中加入EB。
                   
                    7、 在紫外燈下,由于EB發出強烈的橘紅色的熒光,所以可以看到DNA帶。利用這種方法檢測的界限是每條帶約10ng DNA。帶上塑料安全眼鏡可防止紫外光對眼睛的傷害??捎贸咦觼頊y量每條帶至點樣孔的距離。同樣,利用特制的照相機和調焦器,也可以對凝膠拍照。
                   
                    8、 如果要對某一條帶(如質粒)進一步分析,可用小刀將含該帶的凝膠切割下來,從帶中回收DNA。
                   
                    瓊脂糖核酸電泳實驗操作流程
                   
                    1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈,放在制膠平板上,封閉模具邊緣,架好梳子;
                   
                    2.根據欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠:準確稱量瓊脂糖干粉,加入到配膠用的三角燒瓶內,定量加入電泳緩沖液(一般20~30 ml);
                   
                    3.放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻,加入一滴熒光染料,輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液,倒入電泳槽中,待其凝固;
                   
                    4.室溫下30~45分鐘后凝膠*凝結,小心拔出梳子,將凝膠安放在電泳槽內;
                   
                    5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mm為宜,如樣品孔內有氣泡,應設法除去;
                   
                    6.在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液(loading buffer),混勻后,用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內;
                   
                    7.接通電源,紅色為正極,黑色為負極,切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60~100V電壓,電泳20~40min即可;
                   
                    8. 根據指示劑泳動的位置,判斷是否終止電泳;
                   
                    9.電泳完畢,關上電源,在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。
                   
                    瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最jia分辨范圍
                   
                    0.5%1,000~30,000
                   
                    0.7%800~12,000
                   
                    1.0%500~10,000
                   
                    1.2%400~7,000
                   
                    1.5%200~3,000
                   
                    2.0%50~2,000
                   

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